PCR反應混合物的分子實驗檢測步驟介紹

進行分子實驗檢測時需要先準備PCR反應混合物：根據(jù)DNA樣本的數(shù)量來確定除了DNA外其他混合物的體積（額外增加一份來確保有足夠的PCR反應混合物），將擴增每一個遺傳標記并且在每一個PCR反應管內(nèi)分19.5uL的反應混合物。
　　配制膠溶液：將25g尿素、7.5mL40%丙烯酰胺：PDA(19:1)加入到250mL的錐形瓶中。加蒸餾水至50mL，充分混勻來溶解尿素(見注釋4)。
　　準備制膠板：把膠板洗干凈，確保上面沒有灰塵，用硅化玻璃板。根據(jù)各個廠家的不同把玻璃板夾在一起并且用膠條封住底部（這一過程根據(jù)設備的不同而有所變化)。
　　如果不用帶有加熱蓋的PCR儀，那么就需要在每個管子的頂部加入礦物油來防止液體蒸發(fā)。
　　進行分子實驗檢測時在每個管子中加0.5的DNA樣本。
　　把管子放在PCR儀中，95℃加熱3min變性DNA。
　　95℃變性40s、55℃引物退火40s、72℃延伸40s，循環(huán)30-35次。
　　把PCR產(chǎn)物和尿素上樣緩沖液1:1混合.
　　加入500uL10%的過硫酸銨到膠混合液中并且通過濾紙過濾。
　　取出10mL膠溶液加入到一個小燒杯中并且加10~15。馬上將膠倒到板上。幾分鐘之內(nèi)膠將聚合到一起，封玻璃板的底部。
　　封好膠后，加15ul到剩余的膠溶液中并且馬上把膠倒到兩塊膠板之間。仔細插入膠梳子，讓膠聚合2h至過夜。
　　取下膠底部的封條。把膠放在電泳槽中確保電極插入的方向正確。將膠槽中灌滿(大約1.5L，根據(jù)裝置的不同量有所不同）。拔掉膠梳子，沖洗上樣孔。
　　把膠預熱60min直到溫度在50℃左右。
　　在上樣之前再次用加樣器沖洗上樣孔。在每個孔中加產(chǎn)物和上樣染料（上樣量根據(jù)梳子的大小和PCR產(chǎn)物的濃度而不同）。根據(jù)產(chǎn)物片段大小的不同跑膠時間可以從30min到3h之間變化。