細胞活性氧實驗

    活性氧(reactive oxygen species , ROS)是體內一類氧的單電子還原產物,，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2 %的氧生成的，包括氧的一電子還原產物超氧陰離子(O2·-)、二電子還原產物過氧化氫(H2O2)、三電子還原產物羥基自由基(·OH)以及一氧化氮等。
    ROS 的產生主要是線粒體由狀態Ⅲ向狀態Ⅳ轉換中高氧的環境和高還原態的呼吸鏈使大量電子漏出并還原氧分子而形成。

檢測方法
1、化學反應法
由于活性氧具有較高的反應活性, 它們可以與許多不同的化合物發生化學反應, 由此產生各種不同的反應生成物, 根據這些反應生成物或者反應物的變化程度可以進行定量或者定性分析。通常采用的儀器分析方法有, 化學發光法 、紫外-可見吸收分光光度法 、熒光光度法 、電子自旋探針 以及選擇性電極法等。化學反應法的特點是測定靈敏度高、廉價、操作簡便等。但是, 化學反應法的特異性相對比較差, 一些氧化還原反應或者酶催化反應往往對測定結果的判斷產生影響, 一般需要其他分析方法作為比較, 才能獲得滿意的結論。

2、化學發光法
化學發光測定法是儀器分析中靈敏度較高的方法之一, 已在醫學、環境以及工業分析等許多領域里得到廣泛的應用 。活性氧的化學發光研究也是活性氧測定法研究領域中比較活躍的分支之一, 特別是針對H2O2 測定, 有許多靈敏度高、選擇性好的化學發光體系 。進年來, 筆者在H2O2 測定方面開發了一系列高靈敏度的化學發光分析法。除此之外, 目前比較成功的活性氧化學發光測定法主要有魯米諾法(luminol)、光澤精法(lucigenin)和cypridina luciferin analog(CLA)法。
3、分光光度法
活性氧的分光光度測定, 常用的方法有細胞色素丙(cytochrome C)的超氧自由基還原法 和硝基四氮唑籃(nitro blue tetrazolium ,NBT)還原法 。具有氧化活性的細胞色素C 被·O-2 還原后, 形成了在波長550 nm 處有強吸收的亞鐵細胞色素 , 可以用于O-2 的直接測定, 在SOD 存在下,O-2 受到SOD 的催化形成H2O2 和O2 , 以被開發為SOD 的間接定量分析法 。 
但是, 活性氧的細胞色素丙還原法存在著其它還原性物質, 如HADPA 和還原性酶的干擾, 一般情況下無法直接用于O-2 的定性分析, 需要比較在SOD 的存在下, 是否還有O-2 與細胞色素丙發生反應的結果, 從而判斷O-2 的生成與否。

4、熒光光度法
與化學發光一樣, 熒光分光光光度法也是靈敏度高, 操作簡便的分析方法之一。比較典型的例子是, 二氯熒光素(DCFH)在過氧化物酶存在下, 被H2O2 或者HO-2 氧化形成具有有螢光的DCF , 可以有效地應用于H2O2 定量分析[ 23] 。利用2 , 3-二氨基萘(DAN)與NO-2 在酸性條件下發生反應, 形成熒光性的1-(H)-萘三氮茂環, 有人提出用2 , 3-二氨基萘(DAN)作為NO 的測定方法。