細胞凋亡誘導技術(shù)

【實驗方法與步驟】

  （1）細胞凋亡的誘導：HeLa細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期(見細胞傳代培養(yǎng)）。實驗組細胞加入順鉑溶液（生理鹽水配置）至終濃度為20μmo1/L,37℃，5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。空白實驗對照加入等體積的生理鹽水，同樣條件繼續(xù)培養(yǎng)。24h后進行染色及形態(tài)學觀察。

  （2）胰酶消化細胞，將培養(yǎng)基上清及消化下來的細胞一同轉(zhuǎn)入離心管中600~800r/min離心10min。

  （3）吸去上清，用1mL PBS重懸細胞沉淀，并轉(zhuǎn)入1.5mL微量離心管中，600~800r/min離心10min。

  （4）吸去上清，用500μL PBS重量細胞沉淀，取178μL轉(zhuǎn)入0.5mL的微量離心管中，加入PI 20μL（終濃度100μg/mL），Hoechest 33342 2μL（終濃度10μg/mL），混勻，37℃溫箱中避光標記15min。

  （5）600~800r/min離心10min，棄上清，加50μL PBS重懸細胞。

  （6）分別從實驗組及對照組中取10μL細胞懸液滴于載玻片上，蓋上蓋玻片。

  （7）熒光顯微鏡20倍物鏡在紫外光激發(fā)下觀察，可觀察到凋亡細胞核形態(tài)發(fā)生明顯的改變，出現(xiàn)染色質(zhì)凝集及邊緣化。

  【注意事項】

  （1）誘導細胞凋亡后收集細胞時，注意要同時收集細胞培養(yǎng)基上清液。

  （2）懸浮細胞時動作要輕柔，避免損傷細胞。

  （3）在實驗中可同時設(shè)計壞死細胞的對照，例如，取正常細胞經(jīng)低滲后進行染色觀察。