ELISA 實驗常見問題解析

   ELISA實驗因靈敏度高，特異性強在生物科研上得到了廣泛的認可，但對初學者而言，如不注意實驗操作過程中的各個環節，可能會對最終的實驗結果產生比較大的影響，比如實驗出現白板，顯色弱靈敏度低，花板無梯度背景高等現象。下面對以上實驗現象進行一一解析。

     1.白板現象
     在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中所有孔的顏色均為無色，即無信號呈現。出現該現象的可能原因：試劑已過保質期，不同批次稀釋液交叉使用。錯加漏加檢測A，檢測B或者底物溶液TMB。洗板或者加樣過程中，酶標記物被污染失活，稀釋液中含有酶抑制劑如疊氮吶等。配置稀釋液的蒸餾水可能被污染。洗滌液是濃縮型的，沒有按比例進行稀釋。酶標記物的活性和效價比較低。溶液的PH值不正確，一般稀釋液的PH值應保持在7.2-7.4。
 
     2.顯色弱靈敏度低
     在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中孔的顯色比較淺，即只有微弱的信號呈現。出現該現象的可能原因：產品過有效期，試劑沒有按規定進行適當的保存。試劑，標準品或者樣品在使用前沒有平衡到室溫。少加了試劑的量或者加入試劑的稀釋比例不當。洗板或者加樣過程中，酶標物受污染失活。孵育時間和孵育溫度未達到實驗要求。洗滌液稀釋倍數不符合要求，洗板次數過多，洗板沖擊力過大，洗板浸泡時間過長。底物溶液TMB顯色時間太短。
 
    3.花板無梯度背景高
    在完成所有實驗步驟進行底物TMB溶液顯色后，酶標板中的孔有顏色但沒有梯度，背景也可能較高，。出現該現象的可能原因：底物溶液TMB未置于陰涼避光處保存，實驗前溶液已經變藍。孵育溫度過高或者孵育時間過長，發生了較強的非特異性吸附。沒有按說明書要求洗板，特別是洗板時洗滌液的量少加了。加樣時沒有換槍頭造成交叉污染。花板現象：低濃度或者低活性的包被抗體或者檢測抗體，封閉不足導致的本底不穩定，洗板不充分，包被板子的問題。
 
    綜上所述：在ELISA實驗中應注意以下問題：
    1.在實驗前應該按相關要求將實驗試劑平衡至室溫。
    2.包被抗體和檢測抗體應該是有高活性的且都針對同一抗原。
    3.試劑保存：蛋白抗體類試劑保存于-20攝氏度，顯色液洗滌液保存于2-8攝氏度。
    4.各試劑在使用前應充分混勻，以保證試劑的均一性和準確性。
    5.嚴格控制反應溫度和反應試劑。
    6.洗板次數，洗板液的量，洗板液浸泡時間的長短，洗板的力度都是應該注意的問題。
    7.相關濃縮液應按要求稀釋到相應比例方可使用，PH值要保持在7.2-7.4之間。
    8.在終止反應時盡量避免微孔中存有氣泡。

    9.終止反應完成后應該在2min內完成酶標儀讀數。（轉載）