細(xì)胞技術(shù)及活力測(cè)定

一、原理

      培養(yǎng)的細(xì)胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長(zhǎng)良好，所以要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)結(jié)果以每毫升細(xì)胞數(shù)表示。細(xì)胞計(jì)數(shù)的原理和方法與血細(xì)胞計(jì)數(shù)相同。

在細(xì)胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細(xì)胞，總細(xì)胞中活細(xì)胞所占的百分比叫做細(xì)胞活力，由組織中分離細(xì)胞一般也要檢查活力，以了解分離的過(guò)程對(duì)細(xì)胞是否有損傷作用。復(fù)蘇后的細(xì)胞也要檢查活力，了解凍存和復(fù)蘇的效果。

      用臺(tái)盼蘭染細(xì)胞，死細(xì)胞著色，活細(xì)胞不著色，從而可以區(qū)分死細(xì)胞與活細(xì)胞。利用細(xì)胞內(nèi)某些酶與特定的試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，也可測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力。

二、儀器、用品與試劑

      1、儀器與用品：普通顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板、試管、吸管、酶標(biāo)儀（或分光光度計(jì)）

      2、試劑：0.4%臺(tái)盼蘭，0.5%四甲基偶氮唑鹽（MTT）、酸化異丙醇

      3、材料：細(xì)胞懸液

三、操作步驟

（一）細(xì)胞計(jì)數(shù)

      1、將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。

      2、將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間。

      3、靜置3分鐘。

      4、鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按下式計(jì)算：

      細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)/ 4×10000

      注意：鏡下偶見(jiàn)由兩個(gè)以上細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)占10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液。

（二）細(xì)胞活力

      1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。

      2、加入0.5ml 0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2一3分鐘。

      3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

      4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)細(xì)胞活力。

      死細(xì)胞能被臺(tái)盼蘭染上色，鏡下可見(jiàn)深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無(wú)色透明狀。

      活力測(cè)定可以和細(xì)胞計(jì)數(shù)合起來(lái)進(jìn)行，但要考慮到染液對(duì)原細(xì)胞懸液的加倍稀釋作用。

（三）MTT法測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力

      活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶可使MTT分解產(chǎn)生蘭色結(jié)晶狀甲贊顆粒積于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍。其量與細(xì)胞數(shù)呈正比，也與細(xì)胞活力呈正比。

      1、細(xì)胞懸液以1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

      2、沉淀加入0.5-1ml MTT,吹打成懸液。

      3、37℃下保溫2小時(shí)。

      4、加入4-5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。

      5、1000 rpm離心，取上清液酶標(biāo)儀或分光光度計(jì)570nm比色，酸化異丙醇調(diào)零點(diǎn)。

      注意：MTT法只能測(cè)定細(xì)胞相對(duì)數(shù)和相對(duì)活力，不能測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)數(shù)。

      附：1、0.4%臺(tái)盼蘭染液配制：

      臺(tái)盼蘭 0.4克 加雙蒸水至100 ml.

      2、MTT配制：

      MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸緩沖液或無(wú)酚紅的基礎(chǔ)液中。4℃下保存。

      3、酸化異丙醇配制：

      異丙醇中加入HCl使最終達(dá)0.04mol/L。

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